Tinh sạch phức hợp Rave từ Saccharomyces cerevisiae bằng việc sử dụng FLAG tag

Tóm tắt

RAVE (Regulator of the H⁺-ATPase of the Vacuolar and Endosomal membranes) là một nhân tố cần thiết cho quá trình lắp ráp và tái lắp ráp của V-ATPase. Phức hợp RAVE có ba tiểu đơn vị đó là: Rav1p, Rav2p và Skp1p. Hiện nay có rất ít những nghiên cứu về phức hợp RAVE. Vì vậy việc nghiên cứu cấu trúc của phức hợp RAVE là rất quan trọng để hiểu rõ về quá trình điều hòa sự lắp ráp cũng như là tái lắp ráp của V-ATPase. Trong nghiên cứu này, phức hợp RAVE được tinh sạch bằng ái lực, dựa vào việc gắn FLAG tag vào tiểu đơn vị Rav1p hoặc là Rav2p. Quá trình thí nghiệm: Tế bào nấm men được nuôi trong 8 lít môi trường lỏng YEPD ở 30 ^oC, lắc ở 200 rpm, cho đến khi OD_600nm khoảng 3. Sau đó tế bào sẽ được phá vỡ bằng thiết bị French pressure cell disruptor ở 25000 p.s.i trong đệm TBSE (50 mM Tris/Cl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,4) với 1 mM PMSF. Dịch tế bào sau khi được phá vỡ sẽ được ly tâm ở 20000 xg trong 20 phút ở 4 ^oC. Tiếp theo, toàn bộ dịch nổi được chạy qua cột sắc ký có chứa 1 ml anti-FLAG M2 gel. Sau khi rửa cột anti-FLAG với đệm TBSE, phức hợp RAVE sẽ được rửa giải với đệm TBSE có chứa 100 µg/ml FLAG peptides. Kết quả thu được chỉ ra rằng, việc tinh sạch phức hợp RAVE bằng cách gắn FLAG tag vào đầu C của dưới đơn vị Rav2 từ nấm men S. cerevisiae tốt hơn là khi tinh sạch phức hợp RAVE bằng cách gắn FLAG tag vào đầu N hoặc đầu C của dưới đơn vị Rav1